破骨细胞诱导分化机制
破骨细胞是一种独特的多核细胞，源自造血干细胞分化而来的巨噬细胞，专门负责骨吸收过程。RANK L/RANK/OPG信号通路是调控破骨细胞分化的核心枢纽，可精密调控破骨细胞与成骨细胞的活性平衡，确保骨骼稳态。[1]
RANK L/RANK/OPG信号通路在诱导破骨细胞活化和失活中的调控作用
核因子κB 受体活化因子配体（Receptor Activator for Nuclear Factor-κBLigand，RANK L）被认为是促进破骨细胞最为分化成熟及其功能活性最重要的因子，M-CSF可诱导RANK在破骨细胞前体的细胞膜上表达，进而使表达RANK的破骨前体细胞和RANK L结合并产生效应，诱导破骨细胞分化。
破骨细胞在体内数量少，仅占分离细胞0.8%-1.2%，在体外分离培养比较困难，现在破骨细胞主要采用诱导法，常用的是骨髓单核细胞诱导法和RAW264.7细胞系诱导法。
破骨细胞诱导实验方法及注意事项
骨髓单核细胞诱导法[2]
01选用8-12周龄雄性C57BL/6J小鼠，采用CO2吸入法处理后，浸泡于50mL 75%乙醇中5分钟进行消毒。
02 无菌操作下完整取下小鼠后肢，剔除股骨和胫骨上多余的皮肤与肌肉组织，随后将骨头置于10mL含有2%青霉素-链霉素的PBS溶液（4℃预冷）中。
03 分离胫骨和股骨，用2mL含2%青霉素-链霉素的PBS溶液清洗两次，每次5分钟。
注意：小鼠骨髓单核细胞提取过程全程注意无菌操作，避免污染。
04 用10mL注射器（配备25G针头）向骨头两端注入α-MEM，将骨髓细胞冲洗出来，然后将这些细胞通过70μm细胞筛网过滤到一个50mL的离心管中。反复冲洗直至骨髓腔内不再有明显的红色残留。每块骨使用约8mL的α-MEM进行冲洗，以收集细胞，并将所有骨髓细胞在室温下临时保存于50mL的锥形管中。
注意：可用润洗液提前将细胞筛网、50mL离心管进行润洗，以减少粘附，提高细胞收率。
05 室温下400×g离心5分钟，弃去上清液，加入3mL红细胞裂解缓冲液，室温静置2-3分钟裂解红细胞。
06 加入5mL含10% FBS的常温α-MEM培养基终止裂解，300×g 离心3分钟，弃上清。
07 将细胞重悬于20mL含20-50ng/mL M-CSF (CB34)的完全培养基中，转移至两个10cm培养皿，在37℃、5% CO₂的培养箱中过夜培养。
08 12小时后，收集未贴壁的细胞，接种至10cm培养皿中继续培养，培养基为含10% FBS和20-50ng/mL M-CSF的α-MEM培养基。
注意：细胞种板密度过高，或M-CSF浓度添加太高，可能导致细胞增殖过快，影响后续破骨诱导。
09 每隔一天换液，培养2-3天，直至贴壁细胞达到80%-90%融合。
10 提前在24孔板中放置盖玻片，收获骨髓细胞，以终浓度为1.6-2.0×106 cells/mL、每孔0.5mL的量接种到放有盖玻片的24孔板中，培养基为含20-50ng/mL M-CSF的α-MEM培养基。
11 12小时后，更换为含有20-50ng/mL M-CSF (CB34)和50-100ng/mL RANK L (C28A)的10% FBS的α-MEM培养基，此后每隔一天换液，诱导6-8天，期间破骨细胞在第4-5天形成。
12 按照TRAP染色试剂盒说明书对24孔板中的细胞进行染色，在显微镜下观察，具有三个或更多细胞核且呈深红色至紫色的TRAP阳性细胞即为破骨细胞。
破骨细胞（Trap染色）
注意：破骨细胞诱导成熟后，请尽快进行Trap染色，24h后破骨细胞会破碎。
RAW264.7细胞系诱导法
01 细胞培养：常规培养于含10%FBS的DMEM中，置于37℃、5%CO2的加湿培养箱中，每隔一天更换培养基。当细胞汇合度达到80%-90%时，用移液器或巴氏管将细胞轻轻吹下，避免使用胰酶消化，收集细胞后以1:2~1:3的比例传代。
注意：细胞培养时，如果镜下较多细胞出现伪足时，细胞整体状态可能不好，这时的细胞不适合用于诱导破骨。
02 用含10%FBS的α-MEM培养基将RAW264.7细胞制成细胞悬液，以2×104 cells/孔的密度接种于24孔板中。
注意：根据相关文献报道，该细胞浓度下破骨诱导程度最高，但不同实验室培养条件及细胞亚型均可能有差异，因此在有条件的情况下建进行最佳种板密度的摸索，以获得最佳破骨细胞诱导效果。
03 细胞接种12h后，加入100-150ng/mL RANK L (C28A)。
注意：此处100`150ng/mL RANK L，是统计大部分客户实际培养使用的浓度，不同实验室RAW264.7细胞来源、亚型、种板密度等。
04 每3天更换培养基，并同时补加20-100ng/mL RANK L。
05 较为明显的多核破骨细胞将在分化培养4天后开始出现，并在第5天至第6天逐渐变得丰富。
06 进行TRAP染色，鉴定破骨细胞。
近岸蛋白提供高活性、高批间一致性的重组M-CSF和RANK L蛋白，助您稳定高效诱导破骨细胞。
产品数据
高活性重组M-CSF和RANK L蛋白
Measured in a cell proliferation assay using M-NFS-60 mouse myelogenous leukemia lymphoblast cells.The ED50 for this effect is 0.04-0.2 ng/ml.
Measured by its ability to induce osteoclast differentiation of RAW 264.7 mouse monocyte/macrophage cells.（RANK L：Cat.No.:C28A）
参考
- ^Aidos et. Root Resorption Classifications: A Narrative Review and a Clinical Aid Proposal for Routine Assessment. European Endodontic. 2018.
- ^Zhuang, X. and G. Hu, In vitro Osteoclastogenesis Assays Using Primary Mouse Bone Marrow Cells. Bio-protocol, 2018. 8(11): p. e2875-e2875.