实验室 & 工艺研发用切向流过滤技术简介

简介

切向流过滤（TFF）是对生物分子进行快速、高效分离和纯化的技术，可广泛应用于免疫学、蛋白质化学、分子生物学、生物化学及微生物学等生物学领域。TFF可对10ml至数千升体积的样品进行浓缩和脱盐，也可以用于不同规格物质的分离、收获细胞悬液、澄清发酵液或细胞裂解液。本文将简单介绍TFF的基本原理及其在实验室和工艺研发中的应用。

什么是切向流过滤？

膜过滤是生命科学实验室广泛使用的分离技术，根据膜的孔径，可以分为微滤和超滤。微滤膜孔径一般在0.1μm-10μm之间，常用于澄清、除菌、微粒的去除以及细胞收获。超滤膜的孔径一般在0.001-0.1μm之间，常用于可溶性分子（包括蛋白质、多肽、核酸、碳水化合物及其它生物分子）的脱盐和浓缩、缓冲液置换以及分馏操作，超滤膜的规格一般采用截留分子量（MWCO）来标称。

微滤和超滤都有两种主要的过滤模式：1）直流过滤（DFF），也称为“死端”过滤，进样液流垂直于膜表面，液体100%穿过膜；2）切向流过滤（TFF），也称为错流过滤，进样液流平行于膜表面，部分料液穿过膜（滤液），其余料液（回流液）循环回到进样容器。在DFF中，随着过滤的进行，大分子逐渐聚积在膜表面，并堵塞膜孔，降低过滤通量，即使增加压力，也只能将聚积层压紧，而不能改善过滤状态。在TFF中，沿膜表面流动的料液会将膜表面由于浓差极化而形成的凝胶层“扫掠”清除，从而维持膜的过滤状态，保证小分子通过。所以，相比DFF，TFF更加快速、高效。

直流过滤过程中，进样液流直接穿过膜，比膜孔大的分子聚积在膜表面，形成凝胶，阻碍液流通过。随着过滤体积的增加，凝胶层逐渐增厚，流速迅速降低。

切向流过滤过程中，样品溶液从进样通道进入，沿膜表面流动通过。切向流模式可防止分子在膜表面聚积而造成堵塞，从而减缓过滤流速的衰减，显著提高单位膜表面积的样品处理量。

为什么要使用切向流过滤？

1.TFF设置、使用简单——通过软管和接头将TFF装置简单地连接到泵及压力监测设备，再将样品加载到容器，即可进行操作。

2.TFF快速、高效——相比透析，TFF设置更加简单，也更快速；而与离心相比，TFF可在更短的时间内达到更高的样品浓度。

3.可在单个系统内实现两步操作——可在同一个系统内对样品进行浓缩和洗滤，既节省时间，也可避免样品损耗。

4.TFF可规模放大或缩小——TFF装置和流路构建可根据需要进行规模调整，处理样品体积低可至10ml，高可达数千升。

5.TFF非常经济——TFF装置和流路可清洗再生并重复使用，只需进行简单的完整性测试，并确认组件及密封完好。也可单次使用后作抛弃型处理。

切向流过滤能做什么？

1.蛋白质和多肽浓缩、脱盐

2.核酸（DNA/RNA/核苷酸）浓缩、脱盐

3.从细胞培养液中回收、纯化抗体或重组蛋白

4.从细胞裂解液中回收、纯化质粒DNA或从全血中回收染色体DNA

5.分馏稀释蛋白质混合液

6.细胞裂解液或组织匀浆净化

7.水、缓冲液及注射剂除热源（去除内毒素）

8.柱层析样品制备

9.细胞收获

10.病毒回收或去除

应用

TFF的主要应用包括浓缩、洗滤（脱盐和换液）以及不同规格生物分子的分馏。此外，TFF也可用于发酵液、细胞培养液的澄清。

浓缩

浓缩是指从溶液中去除溶剂而保留溶质分子的简单过程。溶质浓缩的程度与溶液体积的降低呈正比，如体积降低一半，浓度即增加一倍。

进行样品浓缩时，所选超滤膜的MWCO需极低于目标截留分子的分子量，这样才能保证目标分子的完整截留和高度回收。一般情况下，膜的MWCO可以选择为目标截留分子分子量的1/3-1/6。如果过滤通量或处理时间是主要考虑的因素，那么可选择MWCO为目标截留分子分子量1/3的膜，以获得更高的流速；如果需要获得较高的收率，则可以选择MWCO为目标截留分子分子量1/6的膜。

过滤器与系统安装完备后，即可运行系统。推荐先用纯水冲洗系统，并测试过滤器的水通量和完整性。添加待处理料液，进行错流进样，监测进样和回流压力，收集回流液（或滤液）即可。当达到所需的浓度后，停止运行，回收样品或开始洗滤。

洗滤

洗滤实际上是一个分馏过程，小分子通过膜被漂洗掉，而大分子被截留在回流液中且不改变其终浓度。洗滤操作可用于清除盐离子或进行缓冲液置换，也可以用于清除乙醇或其它小分子溶剂或添加剂。

洗滤可以按不同的模式进行。在连续型洗滤中，洗滤溶液（纯水或缓冲液）连续补加到进样容器，其速率与滤液流出的速率相同。在这种模式中，进样容器中样品的体积保持恒定，而小分子（如盐离子）可自由渗透通过膜而被去除。比如在脱盐过程中，每添加1体积的洗滤溶液（1体积为洗滤溶液未添加时的样品的体积），盐离子浓度约可降低一半。在连续型洗滤中，添加5体积洗滤溶液，离子强度一般可降低约99%。

而在间断型洗滤中，溶液先稀释，然后再浓缩回到起始体积，重复操作，直到容器内小分子的浓度降低到要求的浓度。每添加1体积洗滤溶液（1体积为添加稀释溶液前的样品体积），盐离子浓度约可降低一半。在间断型洗滤中，添加5体积洗滤溶液，离子强度一般可降低约96%。

相比而言，连续型洗滤可以较少的洗滤体积达到更好的脱盐效果。

洗滤前对样品进行浓缩可显著降低洗滤溶液的用量。比如通过间断型洗滤将1L样品的离子强度降低96%，约需要5L的洗滤溶液。如果先将样品浓缩10倍，体积降低为100mL，则仅需500mL洗滤溶液即可完成洗滤操作，可显著节省洗滤溶液和时间。但浓缩可能会增加样品的粘度，从而降低过滤流速，操作前可进行预实验，以达到最佳处理效果。

切向流过滤工艺参数

所有的切向流过滤设备的操作都涉及到2个重要的参数：跨膜压（TMP）和错流速率（CF）。

1.跨膜压是使液体及渗透性分子穿过膜的驱动力。

2.错流速率是溶液进入进样通道并通过膜的速率，是对膜表面的聚积层进行“清扫”及滤液流速控制的重要参数。

样品从进样容器泵入进样端口，穿过膜表面（错流），从回流端口流出，回到进样容器。液流可清扫掉截留在膜表面的大分子和聚积物，抑制浓差极化（在膜表面形成的浓缩生物分子层，可堵塞膜孔，造成膜污染）。液体流动通过狭窄的进样通道，在进样和回流端口之间形成压力降。增加错流速率或限制回流端口的软管，可提高此压力。跨膜压是驱动液体穿过膜的动力。

流动通过膜的液体（即滤液或渗透液）可带走比膜孔小的分子。同时调节跨膜压和错流速率可抑制膜污染，提高TFF效率，以在更短的时间内处理更多的料液。

切向流过滤装置

切向流过滤系统一般包括中空纤维切向流过滤组件、蠕动泵、软管、压力传感器及监测系统、样品容器以及相关连接配件。压力传感器一般安装在进样、回流及滤液端口。

不建议在无压力监测设备的情况下进行TFF操作，至少需在泵及TFF组件之间（即进样端口）安装压力监测设备。压力是影响TFF工艺的重要参数。对压力进行监测和控制可得到更加稳定的处理结果，对于系统故障的排除以及工艺的优化都至关重要。

切向流系统操作步骤

1.使用前用纯水浸润并预冲洗中空纤维膜组件，以去除甘油等保护剂。

2.测试膜组件的正常水通量（NWP），作为膜组件性能的基线参考（非必须步骤，如组件重复使用，建议进行测试）。

3.用样品缓冲液润湿并调适系统（对系统进行润湿调适可去除系统内的气泡，调整系统温度，并防止因与非缓冲液溶液接触而可能导致的生物分子的沉淀或变性）。

4.样品处理（浓缩、洗滤或分馏）。

5.清洗，确认清洗效果。

6.储存TFF组件。

怎样选择合适的TFF系统

要根据应用选择合适的TFF系统，可按以下步骤进行：

第一步：明确TFF工艺的目的

我们将样品中的目标生物分子称为产物。选择的分离膜可以是截留产物而去除不需要的低分子量污染物，或者允许产物通过而截留样品的高分子量成分。此外，也可以将两种方式相结合，进行两步操作，分别分离开较高及较低分子量的成分。在第一阶段，选择的膜允许产物通过而截留高分子量成分，然后将第一阶段收集的滤液作为样品，进行第二阶段的处理，此时选择可浓缩产物而去除低分子量物质的膜。

操作前，必需先明确分离目的——浓缩、洗滤或分馏。同时，也需要考虑待处理样品的体积，以及可能的规模放大需求。此外，明确工艺最终要求的浓缩因子及脱盐程度，也是选择合适的膜及系统的关键。

第二步：选择合适的膜截留分子量

膜的截留分子量（MWCO）通常定义为溶液中截留率为90%的分子的分子量。如前所示，需要截留产物时，所选膜的MWCO需为目标蛋白分子量的1/3-1/6。而进行分馏操作时，所选膜的MWCO需低于待截留分子的分子量，且高于需去除分子的分子量。

第三步：选择流道规格

样品的浓度和溶液的状态（粘度、颗粒度等）是流道选择的决定性因素。中空纤维膜过滤器是典型的开放式流道，常规的流道高度为0.5或1.0mm，在进行细胞收获时，这种结构可避免细胞破坏，并使浓缩后完整细胞的收率最大化。在处理高粘度（如血清）或高颗粒含量料液时，也可以达到较为出色的性能。而具有湍流增强型或次流道加强型流道的过滤器通常适合处理较为澄清或已预过滤的料液。

第4步：确定所需的膜表面积

选择合适的过滤器膜表面积取决于待处理料液的体积、预期的处理时间以及要求的终产物体积。

可以根据以下公式计算所需的过滤器膜表面积：