近期，Jin Ye 团队发表的文章 “Identification of hyperoxidized PRDX3 as a ferroptosis marker reveals ferroptotic damage in chronic liver diseases”[1]，鉴定出首个铁死亡特异性标记物--Hyperoxidized PRDX3 (过氧化PRDX3)。该研究结果为铁死亡领域提供了一个期待已久的铁死亡标记物，从而能够更精确地检测这种独特的细胞死亡形式。
缩略词GPX4 : Glutathione peroxidase 4, 谷胱甘肽过氧化物酶 4
SLC7A11: Solute carrier family 7 member 11 , 溶质载体家族 7 成员 11
GSH: Cyst(e)ine-glutathione, 半胱氨酸-谷胱甘肽
GPX4: Glutathione peroxidase 4, 谷胱甘肽过氧化物酶 4
PRDX3: Peroxiredoxin 3, 过氧化过氧化还原蛋白 3
PRDXs: Peroxiredoxins, 过氧化还原蛋白
AFLD: Alcoholic fatty liver diseases, 酒精性脂肪肝
NAFLD: Nonalcoholic fatty liver diseases, 非酒精性脂肪肝
HFD: High fat diet, 高脂饮食
铁死亡是一种由脂质过氧化引起的调节性细胞死亡形式[2]。其主要防御机制是 SLC7A11-GSH-GPX4 轴[3]。在正常情况下 (图 1A)，SLC7A11 介导胱氨酸摄取，并产生半胱氨酸 (Cys, Cysteine)，促进了 GSH 的生物合成。GSH 是 GPX4 的辅助因子，可有效解毒脂质过氧化，抑制氧化应激损伤。
在正常情况下，典型的 2-Cys PRDXs，包括 PRDX1-4，可通过催化性 Cys 来还原过氧化物。反应产生的半胱磺酸 (Cys-SOH) 充当连接剂，利用二硫键连接过氧化 PRDXs 产生同二聚体。Cys-SOH 再被还原为 Cys，又可以重新参与到 PRDXs 的催化循环中 (反应 1-3)。
图 2. PRDXs 的过氧化催化循环[1]。
当过量的过氧化物积累时，二硫键形成的速率不够快，会导致 PRDXs 中的 Cys-SOH 被过氧化物进一步氧化，生成半胱亚磺酸 (Cys-SO2H)、磺酸 (Cys-SO3H)，这是 PRDXs 的过氧化物 (反应 4-5)。因此，脂质过氧化物在铁细胞中的积累可能被 PRDXs 感知，导致蛋白质的过度氧化。
▐ PRDX3 在铁死亡细胞中被特异性过度氧化
作者使用可识别包含 PRDX1-4 的 Cys-SO2/3 H 的肽的抗体进行了免疫印迹分析。结果发现：(1) 在未经处理的 SV589 细胞中几乎检测不到任何信号; (2) 添加铁死亡诱导剂如 erastin、RSL3 或 FIN56 (图中仅显示 erastin) 处理的细胞中观察到~23 kDa 的单条带 (图 3B)。此外，该条带的检测可被抗体与过氧化抗原 (SO3-PRDX1-4 Peptide) 共孵育所阻断，但未被未修饰的对照肽阻断 (图 3B)，表明该抗体特异性靶向过氧化 PRDX1-4。
图 3. PRDX3 在铁死亡过程中被过度氧化[1]。
(A) 通过免疫印迹分析测定用指定浓度的 erastin、RSL3 或 FIN56 (此处未显示) 处理12 小时的 SV589 细胞中的过氧化量和总 PRDX1–4 量。(B) 加或不加 2µM erastin 处理 12 小时的细胞，在不存在 2 µg/mL 阻断性高氧化抗原肽或未修饰的对照肽的情况下进行免疫印迹分析。(C) 加或不加 200 nM erastin2 处理 12 小时的细胞裂解物在同一印迹中通过抗 PRDX3 和抗 SO2/3-PRDX1–4 进行免疫印迹，然后用分别红色和绿色荧光标记的二抗进行检测。
▐ 过氧化 PRDX3 通过抑制胱氨酸摄取诱导铁死亡
作者评估了过度氧化的 PRDX3 对其他化合物诱导的铁死亡的影响，结果表明，PRDX3-/- 能够更敏感地抑制直接作用于胱氨酸转运系统的铁死亡诱导剂（ 例如 erastin 和 SAS），而对作用于下游 GPX4 水平的诱导剂（例如 RSL3 和 FIN56）敏感度降低。也就是说，过度氧化的 PRDX3 很有可能与 erastin 和 SAS 一样，通过抑制胱氨酸摄取来诱导铁死亡 (图 4A)。同时，利用荧光染色定位，研究人员发现本来存在于线粒体的 PRDX3 在过氧化修饰后转移到了细胞膜上(图 4C)。
图 4. 过氧化 PRDX3 可抑制胱氨酸摄取诱导铁死亡[1]。
随后，将细胞与 erastin 预孵育 9 小时 (9 h 后 WT 细胞中产生过氧化 PRDX3)，检查过氧化的 PRDX3 对胱氨酸摄取的影响。结果表明，WT 细胞中的胱氨酸摄取受到抑制，但 PRDX3-/- 细胞中则不受抑制 (图中未显示)，也就是说，过氧化的 PRDX3 可抑制胱氨酸摄取。
▐ 过氧化的 PRDX3 特异存在于铁死亡细胞中
为进一步评估过度氧化的 PRDX3 是否可以作为铁死亡的标志物。作者发现，在 SV589 细胞中，PRDXs 的过度氧化不因为发生细胞凋亡或者坏死性凋亡而产生 (图 5A, C)，也不因为铜死亡诱导剂 Elesclomol 或 CCCP 的处理而产生，PRDX3 只在铁死亡中积累，具有特异性(图 5B,D)。
图 5. 不同细胞死亡类型中，只有铁死亡细胞中存在过氧化 PRDX3[1]。
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本文小 M 带大家一起认识了高分文献中验证 PRDX3 是铁死亡特异性标志物的思路和方法。过度氧化的 PRDX3 通过抑制胱氨酸输入促进铁死亡，决定了它独一无二的身份，为铁死亡研究领域填补了空白的一环。
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铁死亡诱导剂，结合且抑制电压依赖性阴离子通道 (VDAC2/VDAC3)。 |
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铁死亡诱导剂，可直接降低 GPX4 的表达。
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铁死亡诱导剂，可导致 GPX4 降解来诱导铁死亡。 |
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铁死亡诱导剂，还诱导细胞自噬和凋亡。
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铁螯合剂，可结合 Fe(III) 和许多其他金属阳离子。 |
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抗氧化剂和铁死亡抑制剂。 |
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胱氨酸耗竭会诱导铁死亡。 |
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用于测量线粒体膜电位的荧光探针试剂盒。
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亲脂性红色荧光染料，可用于线粒体膜电位检测。 |
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参考文献：
[1] Cui S, et al. Identification of hyperoxidized PRDX3 as a ferroptosis marker reveals ferroptotic damage in chronic liver diseases. Mol Cell. 2023 Nov 2;83(21):3931-3939.e5.
[2] Yan Y, Gan B. Hyperoxidized PRDX3 as a specific ferroptosis marker[J]. Life Metabolism, 2023: load042.
[3] Li J, et al. Ferroptosis: past, present and future. Cell Death Dis. 2020 Feb 3;11(2):88.
[4] Loveless R, Bloomquist R, Teng Y. Pyroptosis at the forefront of anticancer immunity. J Exp Clin Cancer Res. 2021 Aug 24;40(1):264.
[5] Frank D, et al. Pyroptosis versus necroptosis: similarities, differences, and crosstalk. Cell Death Differ. 2019 Jan;26(1):99-114.
[6] Zhao G, et al. Copper induce zebrafish retinal developmental defects via triggering stresses and apoptosis. Cell Commun Signal. 2020 Mar 14;18(1):45.
[7] Wang L, et al. The emerging mechanisms and functions of microautophagy. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023 Mar;24(3):186-203.