阴性对照
在FCM检测中，所有细胞均会产生非特异性荧光，最终结果是细胞自身非特异性荧光与特异性结合荧光的叠加效果。为排除干扰、确保结果可靠，需设置阴性对照——这是一类对照的统称，核心目的是“确定阴性基准、排除假阳性”，根据干扰来源不同可分为空白对照、阴性细胞对照、同型对照等类型，其中空白对照是最基础的类型，各类对照的具体功能与边界如下：
1.阴性对照的核心分类与功能
1.1空白对照：排除“检测系统”相关假阳性
空白对照指未添加任何荧光染色试剂的样本（如仅含细胞和缓冲液的样本），主要针对“检测系统本身”的干扰，核心作用包括：
确定阴性细胞群的基础位置，同时辅助判断细胞大小、颗粒度等固有参数。
区分细胞的本底自发荧光与实验过程引入的非特异性荧光（如试剂残留、操作污染及仪器本底荧光等）。
调节仪器电压参数，使阴性细胞信号处于各通道合适区间，避免电压过低导致“压线”或过高导致信号溢出。
直观呈现细胞的本底信号水平，便于后续圈门分析时直接排除非特异性信号群体。
1.2阴性细胞对照：排除“细胞自身特性”相关假阳性
阴性细胞对照指已知不表达目标抗原的细胞样本，包括未受目标抗原刺激或自然状态下不表达该抗原或经过基因敲除的细胞（如明确不表达CD3的HEK293细胞），主要针对“细胞自身特性”的干扰，核心作用包括：
排除特定细胞系因表面结构、高自发荧光等固有特性导致的假阳性。
验证检测体系对“明确阴性细胞”的识别能力，确保实验体系的特异性。
适用于新细胞样本或未知抗原表达情况的检测场景，作为阳性结果的“阴性基准”。
1.3同型对照：排除“样本-抗体结合”相关假阳性
同型对照指用与特异性抗体同亚型、同荧光素的无关抗体染色的样本，主要针对“抗体非特异性结合”的干扰，详见“同型对照”章节。
2.不同阴性对照的核心区别
3.结果判断与注意事项
3.1空白对照的正常信号标准：参数调节合适后，各检测通道的阳性信号占比应低于0.5%；若细胞自发荧光较强，仅靠补偿调节难以完全消除，需结合实验优化（如更换荧光素、调整样本处理方式）。
3.2对照选择原则：单一对照无法覆盖所有干扰，需根据实验目的组合使用（如常规抗体染色实验，需同时设置空白对照和同型对照）。
3.3局限性明确：空白对照不能替代同型对照/阴性细胞对照，因空白对照未涉及抗体结合、细胞特性等干扰，无法界定阳性门或排除细胞自身相关假阳。
同型对照
这里对同型对照（Isotype Control）的意义做进一步阐明。
流式抗体通过Fab端与靶标进行特异性结合。但白细胞（除T细胞外）表面大多表达CD16、CD32、CD64等Fc受体，这些受体可与各种抗体的Fc端非特异性结合，出现非特异性染色，其中以单核细胞和巨噬细胞尤甚。此外，在活细胞的表面染色实验中，单核细胞和巨噬细胞均存在吞噬抗体的现象。在多色流式实验中，还存在荧光背景的影响及药物处理的影响，即便对Fc受体进行了封闭，在分群不好的情况下，依然需要用到同型对照。
同型对照是用于消除抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，由与一抗具有相同种属来源、免疫球蛋白亚型、亚链和荧光标记方式的非特异性免疫球蛋白构成。与一抗保持相同的荧光染料-蛋白比值，以准确设定阴阳性阈值。其原理是通过匹配一抗的Fc区特征，阻断Fc受体或补体介导的非特异性结合，从而验证抗体结合的特异性。如果没有适合的同型对照，在保持种属来源、荧光标记方式、免疫球蛋白类别相同的条件下，优先选择的顺序应该是类别相同→亚型相同→亚链不同。
实验时，如果仅仅参照阴性对照来圈门，就可能出现一部分假阳性结果。如果参考同型对照来区分阴阳性，就能够把这部分非特异性结合造成的假阳性排除。但同型对照只能作为一种参考，不能直接以此为依据来确定阳性阴性分界点，或以此圈门。因为同型对照只能反映非特异性结合的背景荧光，不能排除其他相关影响因素。
造成非特异性染色的原因有多种，同型对照可以指示实验步骤是否需要进一步优化。如果是由于细胞未完全封闭，同型对照与Fc受体结合，则应该优化封闭条件。如果是由于死细胞的存在，则需要同型对照与活死细胞染料联合使用。
核心作用包括
1.排除抗体因电荷、结构等特性与细胞表面非特异性结合产生的假阳信号。
2.精准界定染色样本的阳性门位置，这是空白对照无法实现的功能，因为空白对照未涉及抗体结合过程。
3.验证阳性信号是否来自特异性的抗原-抗体结合，尤其适用于弱表达抗原的检测场景。
什么时候需要做同型对照？
1.对于阴阳性分群明显的指标，不需要同型对照即可设门，例如CD3、CD4、CD8等用于T细胞的检测指标。对于阴阳性分群不清楚的指标，例如CD25、CD69、CD38等活化指标，及IFN-γ、IL-4、IL17A等细胞因子，则需要设置同型对照。
2.在某些特殊情况下，如单核细胞被PE/Cy7、APC/Cy7等串联染料标记的抗体染色时，因为单核细胞一般倾向于与Cy7等染料非特异性结合，使用同型对照有助于获得理想结果。
3.不清楚抗原表达情况的时候，一定要使用同型对照来界定阴性细胞群。
4.胞内染色时，因为胞内指标表达量一般不会太高，胞内染色过程也非常容易导致抗原抗体非特异性结合。
同型对照注意事项
1.购买同一厂家的流式抗体和同型对照，不同厂家的荧光染料和抗体结合的比率可能是不同的。
2.流式抗体和同型对照的使用剂量和浓度需保持一致。
3.细胞非特异性荧光的强弱由细胞本身所决定，与细胞的体积大小有关，一般细胞体积越大，其非特异性荧光就越强；体积越小，其非特异性荧光就越弱。分析每一种细胞时，都需要设定这种细胞的同型对照，不能用一种细胞的同型对照值分析另外一种细胞，尤其是在体积相差较大时。
4.在进行多色流式实验时，荧光渗漏对结果的影响较为明显，同型对照无法反映出其它通道渗漏的荧光背景。这时就需要通过同型对照与荧光减一对照（Fluorescence Minus One, FMO）的联合使用，即减一对照与被去掉的抗体对应的同型对照抗体的组合对照，消除荧光溢漏和非特异性结合造成的影响。